Filip psal všchno od Paula tak posílám svůj referát do GENETIKY, ale pochybuju že to někdo přečte až do konce

Jako sondu označujeme v molekulární genetice molekulu nukleové kyseliny, kterou použijeme k vyhledání určité sekvence ve vzorku testované DNA nebo RNA. Využíváme při tom schopnost jednovláknových molekul nukleových kyselin tvořit hybridní molekuly, pokud obsahují komplementární sekvence. Sondu si přitom můžeme uměle připravit tak, aby měla námi zvolenou sekvenci. Pro hybridizaci se používají buď dvojvláknové DNA-sondy, nebo jednovláknové RNA-sondy. Vyšetřovaná nukleová kyselina může být také buď dvojvláknová DNA nebo jednovláknová RNA. Pokud jsou sonda nebo vyšetřovaná nukleová kyselina dvojvláknové molekuly, musejí být nejdřív denaturovány. Abychom při detekci "zviditelnili" jenom sondu navázanou na vyšetřovanou DNA, je nutné, aby byla vyšetřovaná nukleová kyselina přichycena k pevnému podkladu. Používají se membrány - nitrocelulózová nebo nylonová - ke kterým lze nukleové kyseliny přichytit různými způsoby.
Pro přesnou hybridizaci proto musí být zajištěna určitá teplota a koncentrace iontů, které lze určit výpočtem či experimentálně. Prakticky se pak hybridizace nejčastěji provádí tak, že se umožní nasednutí sondy za podmínek, které by měly upřednostnit přesné nasedání, ale nejsou natolik stringentní, aby příliš snižovaly účinnost nasedání nasedání (obvykle 65-68 °C ve vodném roztoku nebo 42 °C v 50% formamidu). Pak je vzorek promýván pufrem s nízkou koncentrací iontů při vysoké teplotě, takže dojde k odmytí nepřesně hybridizovaných molekul sondy a na vyšetřované DNA se "udrží" jen sondy dokonale komplementární. Abychom mohli zjistit, zda hybridizace proběhla, musíme mít sondy nějak označeny. Při přípravě se používají označené nukleotidy. Obvykle stačí označit jeden z používaných nukleotidů, takže se v sondě bude v místě každého zařazeného nukleotidu vyskytovat nějaká značka. Tradičně se jako značka používá radioaktivní fosfor, který je v nukleotidu v podobě fosfátu. Další způsob spočívá v připojení molekuly, která může působit jako antigen a být rozpoznávána protilátkami. Pokud je sonda připojena na vyšetřovanou nukleovou kyselin a vyzařuje radioaktivitu, stačí v temnu přiložit citlivý film, nechat ho exponovat a pak vyvolat. Radioaktivita vyvolá vznik tmavé skvrny. U sond označených antigenní molekulou použijeme protilátku, která se na molekulu naváže, a která je sama nějakým způsobem označená - obvykle fluorescenčním barvivem nebo enzymem, jehož přítomnost můžeme detekovat chemickou reakcí. To má výhodu v tom, že se vyhneme nutnosti pracovat s radioaktivitou. Naopak výhodou radioaktivity je vysoká citlivost a jednoduchost provedení.
Pokud chceme zabránit, aby došlo k falešnému navázání sondy, provádí se nejdříve štěpení restrikčními endonukleázami, po kterém následuje rozdělení fragmentů v gelu podle velikosti. Takto roztříděné fragmenty jsou pak na přiloženou membránu přeneseny z gelu
Na membráně tak získáme jakýsi "otisk" rozložení pruhů nukleové kyseliny v gelu. Pokud se detekovaná sekvence (gen) v genomu vyskytuje jen na jednom místě (v jednom konkrétním místě konkrétního chromosomu), pak se bude po štěpení vyskytovat jen v určité části. Po hybridizaci a detekci se nám přítomnost sondy zobrazí jen v tomto místě a můžeme si být jisti, že hybridizace proběhla správně. Průběh hybridizace můžeme pozorovat fluorescenčním mikroskopem. používá se pro tento způsob sond fluorescenční barvivo, jehož přítomnost lze ve zmíněném fluorescenčním mikroskopu detekovat.
Pomocí sond tedy můžeme např. vyšetřit přítomnost chorobné nebo zdravé alely genu, nebo sledovat intenzitu exprese.





Praktický způsob při hybridizaci

denaturace, dvouvláknová DNA nebo SONDA, pomocí chemického roztoku
sondu smícháme s vyšetřovanou NK
odmyjeme sondu a tak zviditelníme tu část sondy která se navázala na vyšetřovanou DNA